Серологические методы изучения антигенов МНС известны уже давно.
Кроме того, используя антисыворотки против различных специфических белков МНС, можно усиливать или подавлять определенные функции иммунитета, что дает возможность изучать функциональную роль различных специфичностей. Поскольку все эти методы дают возможность проводить анализ на микроанали-тическом уровне, они не требуют выделения молекул антигена. Однако при попытках структурного анализа антигенов МНС возникают новые трудности, связанные с двумя особенностями этих антигенов.

Первая из них — это сравнительно низкое количество доступного для работы материала. Так, концентрация антигенов равна примерно 5«105 молекул на лимфоидную клетку (содержание антигенов на других клетках значительно ниже). Если принять, что выход выделяемого продукта составляет 20%, то для получения 5 мг молекул с мол. массой 50 000 потребуется 1012 клеток. Это соответствует примерно 1 кг клеток; для выращивания такого количества клеток потребовалось бы 500—1000 л культуральной жидкости. Между тем селезенка мыши содержит в среднем около 108 лимфоидных клеток.

Вторая трудность на пути изучения антигенов МНС состоит в следующем: эти антигены связаны с мембраной, и, следовательно, в них имеются гидрофобные участки. Из-за наличия в продуктах генов МНС гидрофобных участков с этими молекулами нельзя работать в буферных системах, обычно применяемых при выделении белков, поскольку в таких условиях молекулы агрегируют и становятся нерастворимыми.
Трудности, связанные с выделением антигенов МНС в количествах, доста-точных для структурных исследований, были частично преодолены при изучении антигенов HLA-A и HLA-B человека. В этих опытах культивируемые in vitro линии клеток подвергали скринингу и отбирали линии, продуцирующие аномально высокие количества искомого антигена. Когда удалось получить такие линии от гомозиготных индивидуумов, появилась возможность, используя крупномасштабные методы культивирования, выращивать такие клетки в килограммовых количествах. Эти позволило выделять антигены с помощью обычных биохимических методов и определить их первичную структуру обычным методом секвенирования пептидов. С помощью таких процедур Строминжер [9] полностью или почти полностью расшифровал первичную структуру антигенов HLA-A2 и HLA-B7.
Помимо крупномасштабного выращивания клеток используют также методы, основанные на введении радиоактивной метки в антигены МНС. Например, белки клеточной поверхности можно метить радиоактивным иодом по методу, при котором метка присоединяется к остаткам тирозина на определенных молекулах. Белки можно также пометить, выращивая клетки в культуральной среде, содержащей 3Н-, 14С- или 358-аминокислоты. Методический подход с применением радиоактивной метки имеет то преимущество, что для выделения искомых антигенов можно использовать иммунологические реагенты, не опасаясь проблем, связанных с загрязнением нерадиоактивными белками. Анализу подвергается только радиоактивный материал, поэтому немеченый белок не мешает и может даже быть полезен в качестве носителя радиоактивных молекул. Эта методология нашла широкое применение при изучении продуктов МНС; ее можно использовать также при сравнительном структурном анализе и в более полных структурных исследованиях. Использование радиоактивной метки позволило определить полную аминокислотную последовательность антигенов класса I мыши.

Существует целый ряд методов, позволяющих преодолевать трудности, связанные с нерастворимостью МНС-структур. На ранних этапах изучения антигенов класса I эта проблема была сведена к минимуму путем «срезания» антигенов с клеточной поверхности с помощью протеолитического фермента папаина. Под действием этого фермента гидрофобная часть молекулы остается
погруженной в клеточную мембрану, а несущий антигены внеклеточный участок отщепляется и может быть выделен из надосадочной жидкости. Очевидно, что этот метод позволяет получать лишь неполные молекулы класса I без мем-бранного и цитоплазматического участков. Для получения антигенов класса II расщепление папаином неэффективно; обработка ферментом снимает с поверх-ности клетки лишь около 10% антигенов класса II.

Более общий методический подход к изучению нерастворимых антигенов включает в себя применение неионных детергентов, которые, солюбилизируя ! плазматическую мембрану, «освобождают» мембранные антигены. Особенно удобными оказались растворы детергентов, воздействующие только на плазма-тическую мембрану и не повреждающие ядерной мембраны. Антигены можно выделять из детергентсодержащих супернатантов с помощью обычных иммуно-логических методов, поскольку неионные детергенты не влияют на реакции антител.
На примере работы с солюбилизированными детергентом клетками, вклю-чившими метку в процессе роста в среде, содержавшей радиоактивные амино-кислоты, можно сформулировать общую схему выделения мембранных анти-генов МНС. Применение этой схемы в случае выделения молекул Н-2 мыши изображено на рис. 14.1. До применения иммунологических методов экстракты, полученные с помощью детергента, можно фракционировать на колонках слектином и получить гликопротеиновые фракции. Выделенные антигены легко разделить на составляющие их цепи путем электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН) или путем гель-фильтрации в диссоциирующем растворе.
Прогресс, наблюдаемый в области микросеквенирования белков и в методах разделения гель-электрофорезом, позволит в будущем работать с не мечеными антигенами МНС и исследовать пикомолярные количества антигенов. Это значительно облегчит процедуру анализа антигенов, особенно полученных из источников in vivo.

Другое новое направление, играющее важную роль в исследовании антигенов МНС, — это внедрение технологии гибридомных моноклональных антител. Как было подробно изложено в гл. 13, серологические реагенты для определения (и выделения) антигенов МНС мыши получают путем внутривидовой иммунизации мышей, конгенных по Н-2, Некоторые из таких сывороток не обладают достаточной силой или специфичностью и поэтому не могут быть использованы для выделения антигенов. Было показано, что, используя вместо таких сывороток моноклональные антитела, можно осуществить ранее невыполнимое выделение антигенов. Такие антитела особенно удобны при изучении антигенов человека, поскольку в этом случае внутривидовая иммунизация — процедура не из обычных.