С увеличением количества данных, подтверждающих гетерогенность В-кле-ток, становится очевидным, что разделение пула В-клеток на субпопуляции поможет изучить потенциальную способность В-клеток к синтезу различных классов Ig. Один из подходов, примененный несколькими исследователями, сводится к разделению В-клеток в зависимости от изотипа поверхностных Ig (s-Ig, nig). Результаты работ с использованием положительной и отрицательной селекции достоверно показали, что экспрессирующие s-IgM или s-IgD непростимулированные В-клетки, составляющие большинство В-клеточного пула, дают в системе адоптивного переноса IgM-ответ, за которым следует IgG-ответ. С другой стороны, s-IgG+-^eTKH давали в первую очередь IgG-ответ (см. обзор [18]).

Поскольку в приведенных исследованиях использовали систему адоптивного переноса, а не клонированные В-клетки, трудно было учесть роль таких факторов, как регуляция активации В-клеток in vivo (отрицательная обратная связь у клеток s-IgG+ и s-IgM+ или различная способность к пролиферации у разных подгрупп В-клеток). Поэтому, а также для того, чтобы выявить все минорные популяции клеток (что очень важно, так как на долю клеток, четко коммити-рованных к какому-либо изотипу, приходится 5% В-клеточного пула), аналогичные эксперименты были проведены с использованием фрагментов селезенки для получения клонов, секретирующих антитела [12]. Полученные результаты
говорят о том, что почти 90% от общего клонального ответа первичных В-клеток может быть отнесено за счет В-клеток S-JA+ (табл. 19.1). 60% этих стимули-рованных антигеном клеток S-JA+ дают клоны, секретирующие один или более подклассов Ig. Более чем основная часть первичных В-клеток секретировала более одного изотипа, причем значительная их часть — 3, 4, 5 различных изотипов (табл. 19.2). Эти данные подтверждают то, что образование IgG —процесс, управляемый антигеном, а не запрограммированный в онтогенезе. Кроме того, эти данные свидетельствуют в пользу однолинейной модели экспрессии изотипов, поскольку единственная В-клетка может давать несколько изотипов, в том числе IgG и IgA, при последовательной пролиферации и диффе-ренцировке. Об этом свидетельствует наличие относительно редко встречающейся легкой А-цепи у каждого из тех нескольких клонов, которые были способны секретировать четыре или более изотипов. Это практически исключает всякое сомнение в том, что они являются истинными клонами. Аналогичные опыты независимо провели Джиэрхарт и Цебра [191, которые использовали один и тот же тест с клонированием В-клеток, но разные системы антигенов — фосфорилхолин (ФХ) и динитрофенил (ДНФ) — и разные источники В-клеток (пейеровы бляшки и селезенку). Они установили, что более половины клонов, полученных от положительных В-клеток S-JA+, секретировали IgG и большинство из них секретировало также IgM и IgA.

Связь между фенотипом рецептора и принадлежностью В-клеток памяти к определенному классу также до конца не выяснена. В ряде работ, проведенных в основном с использованием системы адоптивного переноса, было показано, что клеточную память почти целиком можно отнести за счет В-клеток s-IgG и что каждый IgG указывает на принадлежность клетки памяти и ее потомства к определенному классу и аллотипу. Другие исследователи продемонстрировали наличие В-клеток S-}A+, которые восстанавливают IgG-ответ при адоптивном переносе. Кроме того, Пресс и Клинман [20] обнаружили наличие В-клеток, способных давать начало антиген-специфическим клонам, продуцирующим более одного изотипа.
И в этом случае аналогичные работы проводились двумя независимыми группами. Они использовали сортировщик флюоресцирующих активированных клеток (FAGS, ФАКС) для выделения подгруппы В-клеток, несущих определенный изотип, наряду с культивированием фрагментов селезенки для получения в дальнейшем антитело-секретирующих клонов. Тил и др. [12] показали, что чуть больше половины ответа вторичных клонов составляет продукт клеток S-JJ,+, большинство из которых давало начало IgG-секретирующим клонам [12J (табл. 19.1 и 19.2). Важно отметить, что подкласс клеток памяти S-[A~Y+, составляющий 30% от общего ответа, давал IgG-секретирующие клоны, но только в форме IgG (±IgA), но не IgM и IgG. Очевидно, В-клетки, не экспрессирующие больше s-)x, теряют способность секретировать IgM, сохраняя при этом способность к секреции изотипов, кодируемых генами, расположенными с 3-конца относительно гена Сн, включая изотипы IgE и IgA. Точно такие же результаты получили Джиэрхарт и Цебра [19]. При использовании ФХ в качестве антигена большинство В-клеток s-IgG+ дают клоны, продуцирующие IgG, но не IgM. Из этого можно сделать вывод о необратимости переключения с Снц на другие изотипы Сн, что согласуется с делеционной моделью экспрессии Ig.

Противоречивые результаты были получены и в ряде работ, посвященных изучению В-клеток памяти, экспрессирующих на поверхности IgD. В экспери-ментах с применением клеточного сортировщика для разделения клеток наблю-далось сохранение иммунологической памяти s-IgD* и s-IgD"-субпопуляциями клеток памяти после адоптивного переноса в облученного хозяина. Сразу после стимуляции содержание В-клеток этих двух подклассов примерно одинаково, но со временем равновесие смещается в сторону клеток s-IgD~. В системе адоптивного переноса подгруппа В-клеток s-IgD~ восстанавливает значительно более авидный ответ [21]. Предположению о созревании В-клеток s-IgD" в высо-коавидные клетки противоречит ряд экспериментальных данных о персистен-ции памяти у примированных животных; при этом в ответах этих двух субпопуляций практически не наблюдалось никакой разницы [22].

Выделенные по отдельности s-IgD+- и s-IgD "-субпопуляции В-клеток памяти были исследованы в системе клонированных В-клеток. Оказалось, что обе подгруппы вносят значительный вклад в появление клеток иммунологической памяти, но подгруппа s-IgD" была сильно обогащена В-клетками памяти в расчете на одну В-клетку. Кроме того, обе подгруппы были способны давать клоны, секретирующие множественные изотипы, в том числе IgM. Отчетливо показано, что никаких различий в распределении изотипов между клонами субпопуляции s-IgD+ и s-IgD" не выявляется [23].