В связи с тем что недавно были опубликованы обзоры [4, 25], в которых подробно обсуждаются биохимические свойства IL-1 мыши и человека, читателям для получения детальной информации рекомендуется использовать указанные источники. Следует отметить трудность оценки существенной части аналитических биохимических исследований, выполненных до 1980 г., так как количественного анализа активности IL-1 в процессе выделения не проводилось: биологическую активность определяли лишь для одной концентрации каждой полученной фракции (как правило, для разведения 1 : 4). Кроме того, в большинстве случаев биохимической очистке подвергались незначительные количества кондиционированной среды (1—10 л), причем до последнего времени большая часть исследований была осуществлена с супернатантами культур клеток, которые были активны в разведенных от 1 : 5 до 1 : 10. Если биологическая активность IL-1 в количественном отношении подобна активности интерферона, то, по-видимому, концентрация IL-1 в этих супернатантах была очень низка. Действительно, по недавним оценкам 1 ед./мл IL-1 эквивалентна 7-Ю-11 М [33]. Поскольку полученная обычным способом кондиционированная среда содержит 10 ед. IL-1 на 1 мл, то в 1 л ее находится 10 мкг IL-1. В результате, если принять во внимание опубликованные данные о выходе IL-1 после очистки (2—4% от исходного препарата), оказывается, что для выделения 1 мг чистого IL-1 потребовалось бы более 1600 л среды.

Недавно мышиный IL-1 был очищен до гомогенного состояния, что стало возможным главным образом благодаря разработке методики усиленного об-разования IL-1, увеличивающей концентрацию его в среде в 10—20 раз [331. Целесообразно подробно рассмотреть эту работу, поскольку она наглядно демонстрирует, с какими проблемами приходится сталкиваться при очистке лимфокинов.

Источником IL-1 служили клетки мышиной макрофагоподобной клеточной линии P388Dlt которые выращивали до образования монослоя в сосудах для культивирования клеток с площадью 30 см2. Методика стимуляции включала четырехчасовую инкубацию с форболмиристатацетатом (10 мкг/мл), цикло-гексимидом (10 мкг/мл) и бутиратом натрия (2мМ), последующую отмывку клеток, инкубацию в течение 1 ч в присутствии актиномицина D (10 мкг/мл) и, на-конец, культивирование в течение еще 24 ч в среде RPMI 1640, содержащей 1 % сыворотки плода коровы и 2 мМ бутирата натрия. Описанный метод стимуляции давал от 800 до 1500 ед./мл IL-1 (т. е. титр IL-1 составлял от 1 : 80 до 1 : 150). Из-за добавки в культуральную среду 1% сыворотки плода коровы концентрация белка была весьма высокой (264 мг/л). Как видно из табл. 21.1, 4,78 л такой среды последовательно подвергали осаждению сульфатом аммония, хроматографии на фенилсефарозе и ультрогеле АсА54 и изоэлектрофоку-
сированию (ИЭФ). Тридцать процентов активности терялось при осаждении сульфатом аммония, однако оно было необходимо для уменьшения объема супернатанта до такого, с которым можно работать на следующей стадии раз-деления. Значительные потери IL-1 имели место и в процессе гидрофобной хро-матографии на фенилсефарозе: после этой стадии сохранялось лишь 12% пер-воначальной активности. Если пересчитать на объем исходного супернатанта, то окажется, что на этой стадии исследователи имели дело только с эквивалентом 574 мл IL-1 -содержащей среды, и хотя активность повышалась более чем в 1000 раз (от 920 до 108 000 ед/мл) из-за большого количества белка (49 мг), удельная активность возросла лишь в три раза (от 3490 до 10 930 ед./мг). В результате двух следующих стадий очистки (а именно хроматографии на ультро-геле и ИЭФ) активность снизилась еще в 8 раз. В итоге после удаления большей части посторонних белков была достигнута 300-кратная очистка IL-1 (с 3 490 до 1 037 000 ед./мг). Однако из-за больших потерь биологической активности из четырех литров исходного супернатанта был получен образец объемом 4 мл, содержащий очень незначительное количество биологически активного IL-1: титр препарата по сравнению с исходным возрос всего в 18 раз, а именно от 1 : 92 до 1 : 650.

Описанный эксперимент демонстрирует характерные трудности, с которыми приходится сталкиваться при попытке препаративного выделения лимфо-кинов из кондиционированной среды, содержащей сыворотку. Единственным методом, пригодным для уменьшения объема препарата, является осаждение сульфатом аммония, поскольку присутствие сыворотки препятствует концентрированию с помощью ультрафильтрации или вакуумного диализа. Действительно, 70-кратное концентрирование фильтрованием (эквивалент концентрирования, полученного при осаждении сульфатом аммония) дало раствор, содержащий 70% сыворотки плода коровы (СПК) (47,8 мл СПК в 69 мл раствора). При описанной схеме выделения после первой стадии очистки сохраняется лишь 12% первоначальной активности. Низкий выход IL-1 сильно затрудняет его выделение в количествах, достаточных для изучения биологических функций, что в свою очередь препятствует исследованию механизма действия IL-1. И вновь следует вспомнить опыт работы с интерфероном. Препаративное выделение IL-1 могло бы стать несравненно проще, если бы, используя не содержащую сыворотку среду, удалось достичь увеличения исходной активности хотя бы в 100— 1000 раз.
Секретируемый клетками P388DX мышиный IL-1, изученный наиболее полно, обладает следующими свойствами: по данным гель-фильтрации и электрофореза в полиакриламидном геле это белок с кажущейся массой от 12 до 16 к Да, чувствительный к действию протеиназ. Двумерный электрофорез в полиакриламидном геле препарата, частично очищенного по схеме, приведенной в табл. 21.1, выявил наличие четырех различных окрашиваемых пятен в области 14 кДа, различающихся по изоэлектрическим точкам. По-видимому, только три из них обладают активностью IL-1, поскольку с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в трис-глициновом буфере удается выделить лишь три белка, различающихся по заряду и вызывающих пролиферацию ти-моцитов [33] 1.